Relazione della Dott.ssa Vera Chirulli, Premio Bronzetti al XIV Congresso Nazionale SITOX

EFFETTO DEL ß-NAFTOFLAVONE SULL’ESPRESSIONE DI ALCUNE ISOFORME P450 E DI ENZIMI DI FASE II NEL POLMONE DI SUINO
Chirulli V. (1), Fiorio R. (1), Longo V. (1), Marvasi L. (2), Gervasi P.G. (1)
1) Istituto di Fisiologia Clinica, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Pisa; 2) Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Patologia Animale, Università degli Studi di Bologna

Negli ultimi anni è aumentato l’interesse nel suino per le sue applicazioni mediche (xeno-trapianti nell’uomo) e come possibile modello animale per gli studi preclinici di nuovi farmaci. Tuttavia, le informazioni riguardo il sistema metabolico sono scarse, soprattutto a livello dei tessuti extraepatici, incluso il polmone. Quest’ultimo è un organo primario per l’attivazione ed il metabolismo degli inquinanti ambientali (i.e. idrocarburi policiclici) e dei farmaci disponibili per via inalatoria ed ematica. Il BNF è un policiclico che nei roditori induce i citocromi P450 1A1, 1A2, 1B1, 2S1 e alcuni enzimi di fase II (DT-diaforasi, GST, UDP glucuronil transferasi) tramite il recettore AhR (aryl hydrocarbon receptor). Questo studio è stato condotto in suini di controllo e pre-trattati con B-naftoflavone (BNF), per identificare in vari organi di questa specie la presenza e regolazione degli ortologhi dei suddetti geni.
Nel nostro lavoro sono stati usati sei suini maschi castrati di 2 mesi (di circa 25-30 kg) divisi in 2 gruppi: 3 animali di controllo e 3 trattati i.p. con 40 mg/kg di BNF per 4 giorni e sacrificati 24 ore dopo l’ultimo trattamento. Da ognuno sono stati prelevati il fegato e il polmone per l’estrazione dell’RNA e per la preparazione delle frazioni microsomiali e citosoliche. La tecnica di RT-PCR, mediante “primers” opportunamente disegnati, ci ha permesso di identificare i geni CYP1A1, 1A2, 1B1, 2S1, AhR e GAPDH (gene housekeeping). Nei microsomi epatici e polmonari sono state determinate varie attività marcatrici: etossiresorufina O-dealchilasi (EROD, per CYP1A1/2), metossiresorufina O-dealchilasi (MEROD, per CYP1A1/2), etossicumarina O-deetilasi (ECOD, per i CYP 1A1/2, 2A, 2B, 2E1), acetanilide idrossilasi (AcH, per CYP1A2), 4-Estradiolo Idrossilasi (EH, per CYP1B1) e testosterone idrossilasi (per varie isoforme espresse costitutivamente). Nel citosol sono state determinate le attività DT-diaforasi, Glutatione-S-transferasi (GST) e Uridindifosfato-glucuroniltrasferasi (UDP-GT).
Nei polmoni dei suini di controllo è stata individuata solo l’espressione del CYP 1A1 e AhR. A seguito del trattamento con ?NF si è evidenziato, oltre ad una forte induzione del CYP 1A1, l’espressione del CYP 1B1, 1A2 e 2S1. Le sequenze relative a porzioni dei suddetti geni nel suino, hanno mostrato una più alta omologia con quelle dell’uomo rispetto al ratto.
L’induzione dei CYP1A1 e 1A2 sia nel polmone che nel fegato è stata confermata a livello proteico tramite analisi immunologiche ed enzimatiche. L’ EROD e MEROD (per il CYP1A1/2) sono aumentate di circa 15 volte, mentre l’AcH (per il CYP1A2) di circa 3 volte in entrambi i tessuti. L’ECOD è risultata aumentata nel polmone ma non nel fegato ipotizzando in quest’ultimo organo un maggior contributo di altre isoforme non regolate dal ?NF. L’attività EH, (marcatrice per il CYP1B1 nell’uomo) è stata determinata a livello epatico ma non polmonare, diversamente dall’espressione dei relativi mRNA, suggerendo una diversa specificità di substrato per questa isoforma nel suino. L’idrossilazione del testosterone (marcatore dei CYP3A, 2C, 2A) non è stata modificata dal trattamento con BNF sia nel fegato che nel polmone, in cui è stato determinato solo il 17-OT. A differenza di quanto riportato per i roditori, nel fegato, è stata riscontrata un’ induzione da ?NF della UDP-GT, ma non della GST e DT-diaforasi, ipotizzando una regolazione specie-specifica di questi due enzimi. In accordo con i roditori, nel polmone, questi enzimi non sono stati indotti .
Questo studio riporta nuovi dati sull’espressione e inducibilità da parte del ?NF degli enzimi metabolizzanti gli xenobiotici nel polmone e nel fegato di suino. Inoltre, identifica per la prima volta le sequenze nucleotidiche, anche se parziali, dei citocromi CYP1A2, 1B1, 2S1 e del recettore AhR ed, evidenziando un’elevata omologia con le rispettive sequenze dell’uomo, avvalora l’ipotesi del suino come buon modello per l’uomo.